中国药典（2020年版）第一增补版解决方案-氨基酸分析篇

更新时间：2026-01-30

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氨基酸是人体蛋白质的基本组成物质，除个别芳香族氨基酸外，紫外吸收均较弱，直接使用紫外检测器检测灵敏度低。故氨基酸分析通常需要选择合适的衍生试剂增加氨基酸的生色团，再使用紫外检测器进行检测。目前氨基酸衍生主要包括柱前和柱后衍生两种方法。

柱前衍生化的高效液相色谱法以其操作简单、分析速度快、灵敏度高等优点，成为药典中氨基酸的主要分析方法。常见的柱前衍生试剂有异硫氰酸苯酯（PITC）、6-氨基喹啉-N-(羟基琥珀酰亚氨基)氨基甲酸酯（AQC）、邻苯二醛（OPA）、9-Fmoc-Cl 和2,4-二硝基氟苯（DNFB）等。柱前PITC衍生氨基酸测定法分离效果好，方法技术成熟，适用于含氨基酸种类较多的样品分析。

本方案使用 Leaps超高效液相色谱系统，采用柱前PITC衍生氨基酸测定法对氨基酸注射液以及氨基酸加锌口服液进行分析，测定结果和产品标示值一致，方法稳定可靠。

仪器配置

仪器

Leaps超高效液相色谱系统

Leaps四元泵（P40）

Leaps标准型自动进样器（A10）

Leaps 标准加热型柱温箱（C10）

Leaps紫外-可见检测器（D10）

色谱条件

Chromai Lotus C18（4.6*250 mm, 5 μm）(货号：3.1.04.0009)

流动相A：乙腈-0.1 mol/L醋酸钠溶液（取醋酸钠13.6 g，加水900 mL溶解，用醋酸调pH至6.5，加水至1000 mL）（7:93）

流动相B：乙腈-水（80:20）

检测波长：254 nm；

柱温：40 ℃；

流速：1 mL/min；

梯度洗脱：

时间（min）	流动相A（%）	流动相B（%）
0	100	0
14	85	15
29	66	34
30	0	100
37	0	100
37.1	100	0
45	100	0

实验结果和讨论

标准溶液色谱图

PITC衍生氨基酸标准溶液谱图，如图1所示

图1 氨基酸标准溶液色谱图

线性范围及重复性结果

将不同浓度的系列标准工作溶液分别进样，得到并绘制标准曲线，在线性范围内，线性相关系数均大于0.999，且6针标准溶液保留时间和峰面积的重复性结果良好。

表1 线性范围及重复性结果

化合物名称	线性范围μg/mL	R^2	重复性
化合物名称	线性范围μg/mL	R^2	保留时间RSD%	峰面积RSD%
天冬氨酸	7.14~35.71	0.9994	0.089	0.337
谷氨酸	4.62~23.10	0.9997	0.084	0.336
丝氨酸	3.45~17.26	0.9999	0.099	0.163
甘氨酸	7.04~35.18	0.9999	0.095	0.204
组氨酸	5.62~28.10	0.9999	0.082	0.253
精氨酸	6.90~34.52	0.9998	0.063	0.265
苏氨酸	8.00~40.00	0.9998	0.045	0.245
丙氨酸	11.37~56.85	0.9998	0.046	0.256
脯氨酸	5.12~25.60	0.9998	0.023	0.382
络氨酸	2.96~14.82	0.9999	0.046	0.262
缬氨酸	6.12~30.60	0.9998	0.013	0.379
蛋氨酸	2.83~14.17	0.9999	0.023	0.280
异亮氨酸	3.19~15.95	0.9999	0.012	0.226
亮氨酸	11.90~59.52	0.9999	0.009	0.217
苯丙氨酸	5.95~29.76	0.9999	0.025	0.151
赖氨酸	14.86~74.29	0.9999	0.023	0.150

样品测试结果

对氨基酸注射液和氨基酸加锌口服液同样采用柱前PITC衍生法进行氨基酸测定，得到样品谱图如图2和图3所示，氨基酸测定结果与产品标示值一致。连续进样六针样品溶液，各氨基酸浓度结果RSD%均小于1%，方法稳定可靠。

图2 氨基酸注射液测试谱图

图3 氨基酸加锌口服液测试谱图

总结

采用 Leaps 超高效液相色谱系统，搭配紫外检测器，采用柱前PITC衍生氨基酸测定法，16种氨基酸在线性范围内，线性相关系数均大于0.999。并对氨基酸注射液以及氨基酸加锌口服液进行分析，测定结果和产品标示值一致，且六针样品重现性测试中各氨基酸浓度结果RSD%均小于1%，方法稳定可靠。